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第四节抗体效价与同种自身抗体的检测（第3页）

四、自身抗体鉴定

（一）冷自身抗体

1．冷自身抗体的吸收冷自身抗体的存在较为普遍，它会干扰ABO血型鉴定，干扰配血，掩盖血清中有临床意义的同种抗体。因此要用自身红细胞吸收除去血清的自身抗体，提供合适的血清用于ABO反定型、配血试验和抗体检查。

（1）含有冷自身抗体的标本采集：采1份抗凝标本，置37℃孵育，防止冷抗体吸收到红细胞上，采另1份不抗凝标本置4℃，让红细胞充分吸收冷自身抗体，以后立即分离血清。

（2）吸收方法

1）将温育10min以上的抗凝血样，用37℃生理盐水洗涤3次，分置3个试管中，每管约1ml红细胞，将2ml待检血清加入其中1管混匀，置4℃孵育30～60min，其间摇动数次，使其充分吸收，若吸收不完全，可在第2，第3管重复吸收试验。

2）ZZAP法

所需试剂：①1%半胱氨酸活化木瓜酶溶液。PH7。3PBS。0。2MOLL的二硫苏糖醇：IGDTT溶于32。4mlPH7。3PBS中。2ml受检者血清。2ml自身压积细胞。

方法：ZZAP试剂的配制：①取0。2MOLL二硫苏糖醇溶液2。5ml加0。5半胱氨酸活化木瓜酶溶液，再加2mlPH7。3PBS。②在2管各有1ml压积红细胞的试管中，分别加入2mlZZAP试剂，37℃孵育30min。③用盐水将细胞洗涤次，末次离心至少5min，并尽可能吸净上清液。④在1管处理过的红细胞试管中加入2ml检测血清，4孵育30～40min，离心2min，将血清转入另一管处理好的红细胞试管中，重复一次。⑤吸收以后的血清用来检测同种抗体。

2。冷自身抗体特异性的测定

（1）试剂：①血清和血浆。②试验所需的红细胞；成人O型I阳性红细胞；病人自身红细胞；如果病人不是O型，选择与ABO血型相同的红细胞，如果病人是A或AB型则需要A1和A2细胞；用酶处理的O型I阳性红细胞；O型I阴性脐血和（或）成人I细胞。

（2）方法：①将血清或血浆用盐水倍量稀释从1：2～1：4096（12管），稀释体积不应少于1ml。②每个稀释度取3滴样品加1滴5%试验所需的红细胞，混匀。③室温孵育15min，离心，肉眼观察凝集。④将试管移至4，孵育1H，离心，肉眼观察凝集。

（3）解释：见表12-7。

与OI红细胞反应相同

与冷凝集素综合征有关的最常见的特异性是抗I，但有时也见抗i和抗Pr，有些抗I与抗H抗原强的细胞（O，A2细胞）反应也强，这样的抗体称为抗IH。酶处理的细胞都能增强这些抗体的反应。而抗Pr反应减弱。抗Pr与未处理的I或i细胞反应相同，如果成人细胞和脐带血细胞在酶处理后出现弱的多的反应，首先要考虑抗Pr。

3。冷自身抗体效价的测定

（1）试剂：①血清：37℃采集，37℃分离。②1%O型I阳性红细胞悬液。③PH7。3PBS。

（2）方法：①将血清1：5稀释。②再将血清倍量稀释从1：10～1：20480（12管）。③每个试管加0。5ml1%I阳性红细胞。4℃混匀，4℃过夜。⑤不用离心，肉眼检查凝集。

（3）注意事项：重要的是在进行稀释时，每个稀释度要更换吸管。如果整个过程只用一无能为力吸管，会得到假的高效价结果，差别是很大的。一个表面效价为100000的结果，若单独使用吸管，其真实效价只有4000。大容量的稀释（如0。5ml）比小容量稀释，更精确。

（二）温自身抗体的吸收

有温自身抗体的患者循环中的红细胞包被着自身抗体，血清中也可能还有这种游离抗体。首先需去除红细胞上包被的自身抗体，再用细胞去吸收血清中的温自身抗体，预先用蛋白水解酶处理细胞可改善对抗体的吸收，并减少需要吸收的次数。

1．常规吸收法

（1）将患者的红细胞用温（37℃）生理盐水洗涤3次，1000G离心2min，去上清液。

（2）取1ml压积红细胞加1%木瓜酶或者说%菠萝酶1ml混匀，37℃孵育10min。

（3）洗涤处理红细胞3次，1000G离心2min，最后一次洗涤后要尽量吸净上清液。

（4）将压积红细胞分成2等分，1份压积红细胞加2ml患者血清，混匀37℃孵育30min。

（5）1000G离心2min，将上清液移入第2份压积红细胞中，混匀3℃7孵育30min。

（6）1000G离心2min，吸取经自我吸收后的血清。

2．ZZAP法（木瓜酶DTT）试剂中的二硫苏糖醇能提高IGG分子对蛋白酶的敏感性。在酶的作用下，免疫球蛋白分子失去了完整性与红细胞脱离而蛋白酶又对红细胞表面作了处理，增强了自身抗体的吸收能力。

（1）试剂：①1%半胱氨酸活化木瓜酶溶液。②PH7。3PBS。③0。2MOLL的二硫苏糖醇：1GDTT溶于32。4mlPH7。3PBS溶液中。④2ml血清或血浆。⑤2ml压积自身红细胞。

（2）方法：①ZZAP试剂的配制：取0。2MOLL的二硫苏糖醇溶液2。5ml，加0。5ml半胱氨酸活化木瓜酶溶液，再加2mlPH7。3PBS。②在2管各有1ml压积红细胞的试管中，分别加入2mlZZAP试剂，混匀37℃孵育30min。③用生理盐水将细胞洗涤3次，末次离心至少5min，并尽可能吸尽上清液。④在1管处理过的红细胞试管中，加入2ml检测血清，37℃孵育30min，离心2min将血清转入另一处理的红细胞试管中，重复一次。⑤吸收以后的血清用来检测同种抗体。